生物化學第六章核酸復習筆記_2016年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試生物化學筆記精選
2015年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試順利結束,2016年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試筆試時間預計為2016年9月10日、11日。為方便備考2016年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試的考生復習,環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記_2016年臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試生物化學筆記精選,希望對大家備考有幫助。
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提要
一.概述
核酸分類 分布與功能
二.核苷酸(環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記)
堿基 嘌呤與嘧啶 DNA與RNA中的核苷與核苷酸 多磷酸核苷酸 環(huán)核苷酸
三.DNA的結構
磷酸二酯鍵 DNA的一級結構 DNA的二級結構 DNA的三級結構 DNA的拓撲結構
四.RNA的結構
DNA與RNA的區(qū)別 RNA的種類與功能 tRNA的結構特點 mRNA的結構特點
五.核酸的理化性質(zhì)
紫外吸收 DNA的變性與復性 限制性內(nèi)切酶
第一節(jié) 概述一發(fā)現(xiàn)
核酸占細胞干重的5-15%,1868年被瑞士醫(yī)生Miescher發(fā)現(xiàn),稱為“核素”。在很長時間內(nèi),流行“四核苷酸假說”,認為核酸是由等量的四種核苷酸構成的,不可能有什么重要功能。
1944年Oswald Avery通過肺炎雙球菌的轉化實驗首次證明DNA是遺傳物質(zhì)。正常肺炎雙球菌有一層粘性發(fā)光的多糖莢膜,有致病性,稱為光滑型(S型);一種突變型稱為粗糙型(R型),無莢膜,沒有致病能力(缺乏UDP-葡萄糖脫氫酶)。1928年,格里菲斯發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌的轉化現(xiàn)象,即將活的粗糙型菌和加熱殺死的光滑型菌混合液注射小鼠,可致病,而二者單獨注射都無致病性。這說明加熱殺死的光滑型菌體內(nèi)有一種物質(zhì)使粗糙型菌轉化為光滑型菌。艾弗里將加熱殺死的光滑型菌的無細胞抽提液分級分離,然后測定各組分的轉化活性,于1944年發(fā)表論文指出“脫氧核糖型的核酸是型肺炎球菌轉化要素的基本單位”。
其實驗證據(jù)如下:
1.純化的、有高度活性的轉化要素的化學元素分析與計算出來的DNA組成非常接近。
2.純化的轉化要素在光學、超速離心、擴散和電泳性質(zhì)上與DNA的相似。
3.其轉化活性不因抽取去除蛋白質(zhì)或脂類而損失。
4.用胰蛋白酶和糜蛋白酶處理不影響其轉化活性。
5.用RNA酶處理也不不影響其轉化活性。
6. DNA酶可使其轉化活性喪失。
艾弗里的論文發(fā)表后,有些人仍然堅持蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì),認為他的分離不徹底,是混雜的微量的蛋白質(zhì)引起的轉化。1952年,Hershey和 Chase的T2噬菌體旋切實驗徹底證明遺傳物質(zhì)是核酸,而不是蛋白質(zhì)。他們用35S標記蛋白質(zhì),用32P標記核酸。用標記的噬菌體感染細菌,然后測定宿主細胞的同位素標記。當用硫標記的噬菌體感染時,放射性只存在于細胞外面,即噬菌體的外殼上;當用磷標記的噬菌體感染時,放射性在細胞內(nèi),說明感染時進入細胞的是DNA,只有DNA是連續(xù)物質(zhì),所以說DNA是遺傳物質(zhì)。
1956年,F(xiàn)raenkel Conrat的煙草花葉病毒(TMV)重建實驗證明,RNA也可以作為遺傳物質(zhì)。把TMV在水和酚中震蕩,使蛋白質(zhì)與RNA分開,然后分別感染煙草,只有RNA可以使煙草感染,產(chǎn)生正常后代。
1953年DNA的雙螺旋結構模型建立,被認為是本世紀自然科學的重大突破之一。由此產(chǎn)生了分子生物學、分子遺傳學、基因工程等學科和技術,此后的30年間,核酸研究共有15次獲得諾貝爾獎,占總數(shù)的1/4,可見核酸研究在生命科學中的重要地位。
二、核酸的分類
核酸是由核苷酸組成的大分子,分子量最小的是轉運RNA,分子量25kd左右;人類染色體DNA分子量高達1011kd。核酸分為DNA和 RNA兩類,DNA主要集中在細胞核中,在線粒體和葉綠體中也有少量DNA。RNA主要分布在細胞質(zhì)中。對病毒來說,或只含DNA,或只含RNA。因此可將病毒分為DNA病毒和RNA病毒。
核酸可分為單鏈(single strand,ss)和雙鏈(double strand,ds)。DNA一般為雙鏈,作為信息分子;RNA單雙鏈都存在。
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第二節(jié) 核苷酸一、核苷酸的結構
核苷酸可分解成核苷和磷酸,核苷又可分解為堿基和戊糖。因此核苷酸由三類分子片斷組成。戊糖有兩種,D-核糖和D-2-脫氧核糖。因此核酸可分為兩類:DNA和RNA。
(一)堿基(base)(環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記)
核酸中的堿基分為兩類:嘌呤和嘧啶。
1.嘧啶堿(pyrimidine,py) 是嘧啶的衍生物,共有三種:胞嘧啶(cytosine,Cyt)、尿嘧啶(uracil,Ura)和胸腺嘧啶(thymine,Thy)。其中尿嘧啶只存在于RNA中,胸腺嘧啶只存在于DNA中,但在某些tRNA中也發(fā)現(xiàn)有極少量的胸腺嘧啶。胞嘧啶為兩類核酸所共有,在植物DNA中還有5-甲基胞嘧啶,一些大腸桿菌噬菌體核酸中不含胞嘧啶,而由5-羥甲基胞嘧啶代替。因為受到氮原子的吸電子效應影響,嘧啶的2、4、6位容易發(fā)生取代。
2.嘌呤堿(purine,pu) 由嘌呤衍生而來,常見的有兩種:腺嘌呤(adenine,Ade)和鳥嘌呤(guanine,Gua)。嘌呤分子接近于平面,但稍有彎曲。自然界中還有黃嘌呤、次黃嘌呤、尿酸、茶葉堿、可可堿和咖啡堿。前三種是嘌呤核苷酸的代謝產(chǎn)物,是抗氧化劑,后三種含于植物中,是黃嘌呤的甲基化衍生物,具有增強心臟功能的作用。
此外,一些植物激素,如玉米素、激動素等也是嘌呤類物質(zhì),可促進細胞的分裂、分化。一些抗菌素是嘌呤衍生物。如抑制蛋白質(zhì)合成的嘌呤霉素,是腺嘌呤的衍生物。
生物體中(A+T)/(G+C)稱為不對稱比率,不同生物有所不同。比如人的不對稱比率為1.52,酵母為79,藤黃八疊球菌為0.35。
3.稀有堿基 除以上五種基本的堿基以外,核酸中還有一些含量極少的稀有堿基,其中大多數(shù)是甲基化堿基。甲基化發(fā)生在核酸合成以后,對核酸的生物學功能具有重要意義。核酸中甲基化堿基含量一般不超過5%,但tRNA中可高達10%。
(二)核苷
核苷是戊糖與堿基縮合而成的。糖的第一位碳原子與嘧啶的第一位氮原子或嘌呤的第九位氮原子以糖苷鍵相連,一般稱為N-糖苷鍵。戊糖是呋喃環(huán),C1是不對稱碳原子,核酸中的糖苷鍵都是β糖苷鍵。堿基與糖環(huán)平面互相垂直。糖苷的命名是先說出堿基名稱,再加“核苷”或“脫氧核苷”。
在tRNA中含有少量假尿嘧啶核苷(用Ψ表示),它的核糖與嘧啶環(huán)的C5相連。
規(guī)定用三字母符號表示堿基,用單字母符號表示核苷,前面加d表示脫氧核苷。戊糖的原子用帶’的數(shù)字編號,堿基用不帶’的數(shù)字編號。
(三)核苷酸
核苷中的戊糖羥基被磷酸酯化,就形成核苷酸。核糖核苷的糖環(huán)上有三個羥基,可形成三種核苷酸:2’、3’和5’-核糖核苷酸。脫氧核糖只有3’和5’兩種。生物體內(nèi)游離存在的多是5’核苷酸。用堿水解RNA可得到2’和3’核糖核苷酸的混合物。
稀有堿基也可形成相應的核苷酸。在天然DNA中已找到十多種脫氧核糖核苷酸,在RNA中找到了幾十種核糖核苷酸。
(四)多磷酸核苷酸
細胞內(nèi)有一些游離的多磷酸核苷酸,它們具有重要的生理功能。5’-NDP是核苷的焦磷酸酯,5’-NTP是核苷的三磷酸酯。最常見的是5’- ADP和5’-ATP。ATP上的磷酸殘基由近向遠以αβγ編號。外側兩個磷酸酯鍵水解時可釋放出7.3千卡能量,而普通磷酸酯鍵只有2千卡,所以被稱為高能磷酸鍵(~P)。因此ATP在細胞能量代謝中起極其重要的作用,許多化學反應需要由ATP提供能量。高能磷酸鍵不穩(wěn)定,在1NHCl中,100℃水解 7分鐘即可脫落,而α磷酸則穩(wěn)定得多。利用這一特性可測定ATP和ADP中不穩(wěn)定磷的含量。
細胞內(nèi)的多磷酸核苷酸常與鎂離子形成復合物而存在。GTP,CTP,UTP在某些生化反應中也具有傳遞能量的作用,但不普遍。UDP在多糖合成中可作為攜帶葡萄糖的載體,CDP在磷脂的合成中作為攜帶膽堿的載體。各種三磷酸核苷酸都是合成DNA或RNA的前體。
鳥嘌呤核苷四磷酸酯和五磷酸酯在代謝調(diào)控中起作用,在大腸桿菌中,它們參與rRNA合成的控制。
(五)環(huán)化核苷酸
磷酸同時與核苷上兩個羥基形成酯鍵,就形成環(huán)化核苷酸。最常見的是3',5'-環(huán)化腺苷酸(cAMP) 和cGMP。它們是激素作用的第二信使,起信號傳遞作用??杀涣姿岫ッ复呋?,生成相應的5'-核苷酸。
二、有關縮寫符號
堿基用三字母符號表示,核苷用大寫單字母符號表示,前面加d表示脫氧核苷。戊糖的原子用帶’的數(shù)字編號,堿基用不帶’的數(shù)字編號。
稀有核苷(修飾核苷)也用單字母符號表示,如D表示二氫尿嘧啶核苷,T表示胸苷。如果堿基上有修飾基團,就在表示核苷的大寫字母前加上代表修飾基團的小寫字母,在這個小寫字母的右上方寫明修飾位置,右下方寫明修飾基團的數(shù)量(如只有一個可省略)。如m2G表示2-N-甲基鳥苷,m2,2,73G 表示N2,N2,7-三甲基鳥苷,S4U表示4-硫代尿苷。核糖上的修飾基團寫在表示核苷的大寫字母右邊,如Cm表示2'-O-甲基胞苷。
核苷酸可在核苷符號旁加小寫p表示,寫在左邊表示5'核苷酸,寫在右邊表示3'核苷酸。寫幾個就表示幾個磷酸。3',5'-環(huán)化核苷酸可在前面加小寫c,2',3'-環(huán)化核苷酸可在核苷符號后加〉P,如U〉P表示2',3'-環(huán)化尿苷酸。
三、核苷酸的功能
1.作為核酸的成分。
2.為需能反應提供能量。UTP用于多糖合成,GTP用于蛋白質(zhì)合成,CTP用于脂類合成,ATP用于多種反應。
3.用于信號傳遞。如cAMP、cGMP是第二信使。
4.參與構成輔酶。如NAD、FAD、CoA等都含有AMP成分。
5.參與代謝調(diào)控。如鳥苷四磷酸等可抑制核糖體RNA的合成。又如反義RNA。
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第三節(jié) DNA的結構
一、DNA的一級結構
1.定義
DNA是由成千上萬個脫氧核糖核苷酸聚合而成的多聚脫氧核糖核酸。它的一級結構是它的構件的組成及排列順序,即堿基序列。
2.結構
在DNA分子中,相鄰核苷酸以3’,5’-磷酸二酯鍵連接構成長鏈,前一個核苷酸的3’-羥基與后一個核苷酸的5’-磷酸結合。鏈中磷酸與糖交替排列構成脫氧核糖磷酸骨架,鏈的一端有自由的5’-磷酸基,稱為5’端;另一端有自由3’-羥基,稱為3’端。在DNA中,每個脫氧核糖連接著堿基,(環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記)堿基的特定序列攜帶著遺傳信息。
3.書寫
書寫DNA時,按從5’向3’方向從左向右進行,并在鏈端注明5’和3’,如5’pApGpCpTOH3’。也可省略中間的磷酸,寫成pAGCT。這是文字式縮寫。還有線條式縮寫,用豎線表示戊糖,1'在上,5'在下。
二、DNA的二級結構
(一)雙螺旋結構的建立
DNA雙螺旋結構的闡明,是本世紀最重大的自然科學成果之一。在40年代,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脫水DNA的密度很高,X射線衍射表明DNA中有 0.34nm和3.4nm的周期性結構。1950年,Chargaff通過對堿基的分析發(fā)現(xiàn)了互補配對規(guī)律:在任何DNA中,A=T,G=C,所以有 A+G=T+C。
1953年Watson和Crick根據(jù)Wilkins的DNAX-射線衍射數(shù)據(jù)和堿基組成規(guī)律,建立了DNA的雙螺旋結構模型,從而揭開了現(xiàn)代分子生物學的序幕。當年Watson只有24歲,在劍橋Cavendish實驗室進修,他在美國時就認識到核酸的重要性,所以在大家都在研究蛋白質(zhì)時致力于核酸研究,從而得到了劃時代的成果。
Watson和Crick闡明的是B-DNA結晶的結構模型,與細胞內(nèi)存在的DNA大體一致。近年來又發(fā)現(xiàn),局部DNA還可以其他雙螺旋或三螺旋的形式存在。
(二)B-DNA雙螺旋結構的要點
1.基本結構
DNA雙螺旋是由兩條反向、平行、互補的DNA鏈構成的右手雙螺旋。兩條鏈的脫氧核糖磷酸骨架反向、平行地按右手螺旋走向,繞一個共同的軸盤旋在雙螺旋的外側,兩條鏈的堿基一一對應互補配對,集中地平行排列在雙螺旋的中央,堿基平面與軸垂直。DNA雙螺旋中的兩條鏈互為互補鏈。
2.基本數(shù)據(jù)
雙螺旋外徑2nm,螺距3.4nm,每10對堿基上升一圈。因此每對堿基距離0.34nm,夾角36度。
3. 作用力
有兩種作用力穩(wěn)定雙螺旋的結構。在水平方向是配對堿基之間的氫鍵,A=T對形成兩個氫鍵,GC對形成三個氫鍵。這些氫鍵是克服兩條鏈間磷酸基團的斥力,使兩條鏈互相結合的主要作用力。在垂直方向,是堿基對平面間的堆積力。堆積力是疏水力與范德華力的共同體現(xiàn)。氫鍵與堆積力兩者本身都是一種協(xié)同性相互作用,兩者之間也有協(xié)同作用。
4.大小溝
脫氧核糖磷酸骨架并未將堿基對完全包圍起來,在雙螺旋表面有兩個與雙螺旋走向一致的溝,一個較深較寬,稱大溝;一個較窄較淺,稱小溝。大溝一側暴露出嘌呤的C6、N7和嘧啶的C4、C5及其取代基團;小溝一側暴露出嘌呤的C2和嘧啶的C2及其取代基團。因此從兩個溝可以辨認堿基對的結構特征,各種酶和蛋白因子可以識別DNA的特征序列。
5.修正
以上模型是DNA的平均特征,由于堿基序列的影響,在局部會有所差異。如兩個核苷酸之間的夾角可以從28度到42度不等,互補配對的堿基之間有一定夾角,稱為螺旋槳狀扭曲。螺旋一圈含有10.4個堿基對。
(三)DNA的其他結構
DNA纖維在92%的相對濕度下可形成B-DNA。DNA鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽在75%的相對濕度下可形成A型結構,它也是右手螺旋,但堿基略有傾斜(19度),螺距和骨架結構也稍有不同,每匝11個堿基對,短粗。其生物學意義在于它與雙鏈RNA及DNA-RNA雜合體在溶液中的構象極其相似。由于 2’-羥基的存在,RNA不易采取B型構象,所以在轉錄時,DNA要采取A型構象。一些有機溶劑和蛋白質(zhì)可將B型DNA變成A型構象。
在66%相對濕度的DNA鋰鹽纖維中發(fā)現(xiàn)有C型結構。可以認為C型構象在濃鹽溶液和乙二醇溶液中發(fā)生。此時堆積力降低,氫鍵結合能量相對增加。 C型結構也是右手螺旋,存在于染色質(zhì)和某些病毒中。此外還有D型及被稱為T和P的兩種亞穩(wěn)態(tài)結構。富含A-T對的DNA區(qū)域有較大的結構多樣性。
DNA還有左手螺旋,即Z-DNA。其骨架呈鋸齒走向,在嘌呤與嘧啶交替排列的寡聚DNA中發(fā)現(xiàn),也是反平行互補的雙螺旋,每匝12個堿基對,螺旋細長。這說明DNA的堿基序列不僅儲存遺傳信息,也儲存了自身高級結構的信息。Z-DNA作為特殊的結構標志,與基因表達的調(diào)控有關。
三、DNA的三級結構
(一)超螺旋
DNA的三級結構是指雙螺旋的進一步扭曲。其基本形式是超螺旋,即螺旋的螺旋。三級結構決定于二級結構。B-DNA以每10個堿基一圈盤繞時能量最低,處于伸展狀態(tài);當盤繞過多或不足時,就會出現(xiàn)張力,形成超螺旋。盤繞過多時形成正(右手)超螺旋,不足時為負超螺旋。因為超螺旋是在雙螺旋的張力下形成的,所以只有雙鏈閉合環(huán)狀DNA和兩端固定的線形DNA才能形成超螺旋,有切口的DNA不能形成超螺旋。無論是真核生物的雙鏈線形DNA,還是原核生物的雙鏈環(huán)形DNA,在體內(nèi)都以負超螺旋的形式存在,密度一般為100-200bp一圈。DNA形成負超螺旋是結構與功能的需要。
(二)高級結構的動態(tài)變化
在細胞內(nèi)DNA的高級結構是變化的。通過多種蛋白因子和酶的作用,改變DNA的二級結構和三級結構,是生物功能的需要。DNA的復制、轉錄、重組、修復,都伴隨著其高級結構的變化。在生物體內(nèi),改變高級結構有以下三種方法:
在解鏈酶的作用下,破壞堿基對間的氫鍵,使DNA局部解鏈成為單鏈區(qū),以增加未解鏈的雙鏈區(qū)的盤繞數(shù),從而增加正超螺旋或減少負超螺旋。
通過局部形成Z-DNA(左手)雙螺旋,也可增加B-DNA部分的盤繞數(shù),減少負超螺旋。
通過拓撲異構酶切斷DNA的一條或兩條鏈,在雙螺旋張力的推動下,使斷端繞互補鏈旋轉,釋放張力后再連接,可消除超螺旋,也可引入超螺旋。
DNA的拓撲結構有公式如下:
L=T+W
其中L稱為連環(huán)數(shù),是一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù),必須是整數(shù)。纏繞數(shù)T是雙螺旋周數(shù),W是超螺旋數(shù)。T、W可以是小數(shù)。超螺旋密度一般在-0.03到-0.09之間。
(三)超螺旋的多層次性
真核生物的染色體是DNA與蛋白質(zhì)的復合體,其中DNA的超螺旋結構是多層次的。染色體由染色質(zhì)細絲經(jīng)過多次卷曲而成。染色質(zhì)細絲由核小體重復單位構成串珠狀結構。核小體由DNA和組蛋白組成。組蛋白是富含精氨酸和賴氨酸的堿性蛋白,有H1、H2A、H2B、H3和H4共5種。后四種各2分子組成核小體的蛋白核心,約140bp雙螺旋DNA(核心DNA)在蛋白核心外繞行1.75圈,共同構成核小體的核心顆粒。核心顆粒之間有約60bp的連接 DNA。1分子組蛋白H1結合在連接DNA的進出部位,將核心DNA固定在核心蛋白外圍。核小體呈扁球形,高約6nm,直徑約11nm。由核心DNA與連接DNA構成的核小體重復單位包括約200bp,長度由68nm壓縮至11nm。所以第一次超螺旋使直徑2nm的DNA雙螺旋變成直徑11nm的染色質(zhì)細絲,長度壓縮6-7倍。染色體細絲經(jīng)過再一次超螺旋,形成直徑30nm的染色體粗絲,長度又壓縮6倍。第三次超螺旋使粗絲盤繞成直徑400nm的單位纖維,長度壓縮40倍。最后由單位纖維折疊形成染色單體,長度壓縮4-5倍。這樣,經(jīng)過4次超螺旋,DNA的長度壓縮了近萬倍(8400倍)。
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第四節(jié) RNA的結構
一、RNA的結構特點
1. RNA分子是一條單鏈??梢曰卣郏陨砘パa配對,形成發(fā)夾或稱為莖環(huán)結構。形成局部A螺旋至少要有4-6個堿基對。某些分子中回折可占50%。
2. RNA分子中的核糖有2'-羥基,但不用于成鍵。
3.以尿嘧啶代替胸腺嘧啶,含有多種稀有堿基。
4. RNA是DNA部分序列的轉錄產(chǎn)物,分子量小得多。有些病毒含有RNA復制酶,可以催化以RNA為模板的RNA合成,即RNA的復制。
5. RNA是多拷貝的。
6.RNA按功能分為三類:轉運RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和核糖體RNA(rRNA)。此外還有snRNA和hnRNA。前者與RNA的加工有關,后者是mRNA的前體。
二、轉運RNA
(一)一級結構
轉運RNA是小分子,一般由74-93個核苷酸構成,分子量在25kd上下,沉降系數(shù)4s。其功能是轉運氨基酸,按照信使RNA的堿基序列合成蛋白質(zhì)。20種氨基酸都有專一的轉運RNA,有的還有2種或多種轉運RNA。原核生物有30-40種tRNA,真核生物有50-60種或更多。有報道說有一種RNA(tRNASer)可專一轉運硒代半胱氨酸,可識別UGA(終止密碼)。
tRNA是修飾成分最多的核酸。(環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的約70種修飾成分中,有50種存在于tRNA中。每個tRNA分子都有修飾成分,有的多達十幾個,占全部構件的20%。修飾成分包括修飾堿基和修飾核苷,都是轉錄后由4種標準堿基或核苷加工修飾而成的。在tRNA分子中,修飾堿基主要是甲基化堿基,修飾核苷主要是假尿嘧啶核苷。
(二)tRNA的二級結構
單鏈的RNA借部分序列互補結合,可以形成確定的二級結構。維持二級結構的作用力也是氫鍵和堆積力。RNA分子二級結構的基本單元是發(fā)夾結構。 RNA鏈通過自身回折,兩段互補序列配對形成一段雙螺旋,兩段之間未配對的堿基形成突環(huán)。由雙螺旋和突環(huán)(loop)構成了發(fā)夾結構(hair pin)。回折比例高,結構穩(wěn)定。
tRNA分子都有由一個臂和三個發(fā)夾構成的三葉草形二級結構。tRNA鏈的5’端與3’端序列構成的雙螺旋區(qū)稱為氨基酸臂,其3’末端都有不變的單鏈CCAOH,因末端A結合氨基酸而得名。三個發(fā)夾依次由二氫尿嘧啶環(huán)(DHU loop)與DHU莖、反密碼子環(huán)與反密碼子莖、TψC環(huán)與TψC莖組成。反密碼子環(huán)中央的三個堿基構成反密碼子,與信使RNA的密碼子配對。有些 tRNA在反密碼子莖與TψC莖之間有一個額外的、長度不一的可變莖。
(三)tRNA的三級結構
tRNA分子在二級結構的基礎上進一步扭曲形成確定的三級結構。各種tRNA的三級結構都象一個倒置的L。分子的右上端是氨基酸臂,下端是反密碼子。兩端距離約8nm。不同tRNA的精細結構不同,能被專一的氨基酸t(yī)RNA連接酶和有關的蛋白因子識別。
三、核糖體RNA
高等動物核糖體有4種rRNA成分:18s、28s、5.8s、5s,他們與80多種蛋白質(zhì)共同構成真核生物的核糖體(80s)。核糖體可分解為大小兩個亞基,小亞基(40s)由18s rRNA和33種蛋白構成,大亞基由28s、5s、5.8s rRNA和49種蛋白構成。原核生物核糖體(70s)由三種rRNA與50多種蛋白質(zhì)構成,大亞基(50s)包括23s、5s rRNA和34種蛋白,小亞基(30s)包括16s rRNA和21種蛋白。
多種rRNA的一級結構已經(jīng)測出。rRNA只含少量修飾成分,主要是甲基化核苷酸,包括m7G、m6G等修飾堿基和各種2’-O-甲基修飾核苷。
同種rRNA的二級結構具有共同特點。
四、信使RNA
mRNA作為指導合成蛋白質(zhì)的模板,具有種類多、拷貝少、壽命短、修飾成分少的特點。mRNA的主體序列是編碼區(qū),在其上游5’側和下游都有非編碼區(qū)。真核生物mRNA分子兩端還有5’帽子和3’尾部結構。原核細胞一般沒有尾,某些真核病毒有。
最簡單的帽子結構是掉轉方向的7-甲基鳥苷三磷酸,它與mRNA原來的5’端核苷酸借5’ppp5’連接形成m7GpppN。較復雜的帽子結構在后面的一個或兩個核苷酸還有2’-O-甲基修飾。帽子結構的通式可寫為m7GpppN(m)pN(m)……。帽子結構對穩(wěn)定mRNA及其翻譯具有重要意義,它將5’端封閉起來,可免遭核酸外切酶水解;還可作為蛋白合成系統(tǒng)的辨認信號,被專一的蛋白因子識別,從而啟動翻譯過程。
5’非編碼區(qū)是帽子與編碼區(qū)起始密碼子之間的一段較短的序列,其中包括標志翻譯起始的序列,如原核生物的SD序列。編碼區(qū)由起始密碼子AUG開始,到終止密碼子(UAG、UGA、UAA)截止,編碼一種蛋白質(zhì)的一級結構。其中每三個堿基構成一個密碼子,編碼一個氨基酸。3’側非編碼區(qū)是終止密碼子以后的轉錄序列,其中包括AAUAAA一段序列,可能是添加3’尾的標志,也可能是翻譯終止的協(xié)調(diào)信號。3’端尾部是一段多聚A尾。成熟的mRNA一般在它的3’端都加上了長度為20-200堿基的多聚A尾,作為核膜孔轉運系統(tǒng)的標志,與成熟的mRNA通過核膜孔被運到胞漿有關。
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第五節(jié) 核酸的理化性質(zhì)
一、粘度
大分子溶液比普通溶液粘度大,(環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記)線形大分子又比球形大分子粘度大。DNA是線形大分子,人類二倍體DNA總量3.3×109bp,全長可達 1.75米,DNA分子平均長度在4cm以上,而雙螺旋直徑只有2nm,長度與直徑之比高達107。因此,DNA粘度極高,也極易在機械力作用下折斷。雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA時,由較伸展的雙螺旋變成較緊湊的線團結構,粘度明顯下降。RNA因為分子量小,且呈線團結構,所以其粘度低得多。
二、密度
利用密度梯度離心可以測定大分子的浮力密度。CsCl溶解度大,可制成8M溶液。DNA的浮力密度一般在1.7以上,RNA為1.6,蛋白質(zhì)為 1.35-1.40。分子量相同結構不同的DNA沉降系數(shù)不同,線形雙螺旋DNA、線形單鏈DNA、超螺旋DNA沉降系數(shù)之比為1:1.14:1.4。因此通過測定沉降系數(shù)可以了解DNA的結構及其變化。
三、紫外吸收
嘌呤和嘧啶因其共軛體系而有 強紫外吸收。核酸在260nm有紫外吸收峰,蛋白質(zhì)在280nm。利用紫外吸收可測定核酸的濃度和純度。一般測定 OD260/OD280,DNA=1.8,RNA=2.0。如果含有蛋白質(zhì)雜質(zhì),比值明顯下降。不純的核酸不能用紫外吸收法測定濃度。紫外吸收改變是 DNA結構變化的標志,當雙鏈DNA解鏈時堿基外露增加,紫外吸收明顯增加,稱為增色效應。雙鏈、單鏈DNA與核苷酸的紫外吸收之比是 1:1.37:1.6。
四、DNA的變性
在一定條件下,雙鏈DNA解鏈變成單鏈DNA的現(xiàn)象稱為變性或熔化。加熱引起的變性稱為熱變性;堿性條件(pH>11.3)下,DNA發(fā)生堿變性。此外,尿素、有機溶劑、甚至脫鹽都可引起DNA變性。除去變性因素后,互補的單鏈DNA又可以重新結合為雙鏈DNA,稱為復性或退火。DNA復性由局部序列配對形成雙鏈核心的慢速成核反應開始,然后經(jīng)過快速的所謂拉鏈反應而完成。
DNA變性后粘度降低,密度和吸光度升高。
變性后的單鏈DNA與具有同一性序列的DNA鏈或RNA分子結合形成雙鏈的DNA-DNA或DNA-RNA雜交分子的過程稱為雜交或分子雜交。分子雜交技術的發(fā)展和應用,對分子生物學和生物高技術的發(fā)展起到了重要的推動作用。
通常將50%DNA分子變性時的溫度稱為熔點(Tm)。一般DNA在生理條件下的熔點在85-95度之間。熔點主要取決于堿基組成,G-C對含量越高,熔點越高。一般G-C對含量40%時熔點是87度,每增加1%,熔點增加約0.4度。離子強度也有影響,因為離子能與DNA結合,使其穩(wěn)定,所以離子強度越低,熔點越低,熔解范圍越窄。因此DNA應保存在高鹽溶液中。如果DNA不純,則變性溫度范圍也會擴大。甲酰胺可以使堿基對之間的氫鍵不穩(wěn)定,降低熔點。所以分子生物實驗中經(jīng)常用甲酰胺使DNA變性,以避免高溫引起DNA斷裂。乙醇、丙酮、尿素等也可促進DNA變性。
DNA的復性速度與其初始濃度C0及復雜度有關。當溫度、離子強度等其他條件固定時,一半DNA復性時的C0t值只與其復雜度有關,可用來計算基因組的復雜度。
五、限制性內(nèi)切酶
限制性內(nèi)切酶II識別并切割特定的回文序列,生物體用來防止外源DNA的影響,在基因工程中用于DNA的切割,被稱為分子手術刀。如EcoRI,E是屬名,co是種名,R是菌株名,I是發(fā)現(xiàn)次序。
六、核酸的提純
提?。阂话阆绕扑榧毎?,得到DNP或RNP。然后用酚-氯仿除蛋白,用乙醇或異丙醇將核酸沉淀出來,干燥后再溶解即可。
純化:常用電泳或層析。PAGE一般用于分離1K以下的核酸,如測序。較大的要用瓊脂糖電泳。純化mRNA常用oligo-dT的層析柱或磁珠。
目前核酸研究的特點
八十年代以后,核酸研究有以下特點:
1. RNA研究受到重視。以前的研究以DNA為重點,現(xiàn)在RNA成為研究熱點。核糖酶的發(fā)現(xiàn)和RNA的加工編輯機制是兩大發(fā)現(xiàn)。一個基因在不同組織或不同生理狀態(tài)下,從不同轉錄起始位點開始轉錄,通過不同的剪接方式和不同的3’端成熟機制,可形成不同的蛋白質(zhì),這是一種比基因重排更靈活的調(diào)控方式。RNA的應用也日益廣泛,如用ribozyme切割病毒核酸,用反義RNA阻斷有害基因的表達等。因此,有人稱90年代為RNA的十年。
2.研究材料從原核走向真核。真核生物的復制、轉錄、翻譯都比原核復雜得多,材料的改變導致了ribozyme、RNA的剪接、編輯等重大發(fā)現(xiàn),大大推動了核酸的研究。
3.研究核酸與核酸、核酸與其他生物大分子的相互作用。生物體內(nèi)的核酸多數(shù)處于各種復合物中,其結構與功能都與復合物相關。真核基因轉錄調(diào)控的研究主要集中在順式作用元件(cis-acting elements)、反式作用因子(trans-acting factor)、以及它們之間的相互作用上。核糖體的結構與功能、氨酰tRNA的合成一直是研究核酸與蛋白質(zhì)相互作用的兩個重要對象,近來又形成剪接體 (spliceo-some)、核不均一核糖核蛋白體(hn-RNP)、核小分子核糖核蛋白體(snRNP)、編輯體(editosome)等研究熱點。
研究進入分子水平與整體水平相結合的階段。比如果蠅的發(fā)育受調(diào)控基因網(wǎng)絡的控制,一些實驗室正在以整體與分子水平相結合的方式進行研究。
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本 章 名 詞 解 釋
核苷(nucleoside):是嘌呤或嘧啶堿通過共價鍵與戊糖連接組成的化合物。核糖與堿基一般都是由糖的異頭碳與嘧啶的N-1或嘌呤的N-9之間形成的β-N-糖鍵連接。
核苷酸(uncleoside):核苷的戊糖成分中的羥基磷酸化形成的化合物。
cAMP(cycle AMP):3ˊ,5ˊ-環(huán)腺苷酸,是細胞內(nèi)的第二信使,由于某部些激素或其它分子信號刺激激活腺苷酸環(huán)化酶催化ATP環(huán)化形成的。
磷酸二脂鍵(phosphodiester linkage):一種化學基團,指一分子磷酸與兩個醇(羥基)酯化形成的兩個酯鍵。該酯鍵成了兩個醇之間的橋梁。例如一個核苷的3ˊ羥基與別一個核苷的5ˊ羥基與同一分子磷酸酯化,就形成了一個磷酸二脂鍵。
脫氧核糖核酸(DNA):含有特殊脫氧核糖核苷酸序列的聚脫氧核苷酸,(環(huán)球網(wǎng)校醫(yī)學考試網(wǎng)整理生物化學第六章核酸復習筆記)脫氧核苷酸之間是是通過3ˊ,5ˊ-磷酸二脂鍵連接的。DNA是遺傳信息的載體。
核糖核酸(RNA):通過3ˊ,5ˊ-磷酸二脂鍵連接形成的特殊核糖核苷酸序列的聚核糖核苷酸。
核糖體核糖核酸(Rrna,ribonucleic acid):作為組成成分的一類 RNA,rRNA是細胞內(nèi)最 豐富的 RNA .
信使核糖核酸(mRNA,messenger ribonucleic acid):一類用作蛋白質(zhì)合成模板的RNA .
轉移核糖核酸(Trna,transfer ribonucleic acid):一類攜帶激活氨基酸,將它帶到蛋白質(zhì)合成部位并將氨基酸整合到生長著的肽鏈上RNA。TRNA含有能識別模板mRNA上互補密碼的反密碼。
轉化(作用)(transformation):一個外源DNA 通過某種途徑導入一個宿主菌,引起該菌的遺傳特性改變的作用。
轉導(作用)(transduction):借助于病毒載體,遺傳信息從一個細胞轉移到另一個細胞。
堿基對(base pair):通過堿基之間氫鍵配對的核酸鏈中的兩個核苷酸,例如A與T或U , 以及G與C配對 。
夏格夫法則(Chargaff’s rules):所有DNA中腺嘌呤與胸腺嘧啶的摩爾含量相等(A=T),鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾含量相等(G=C),既嘌呤的總含量相等 (A+G=T+C)。DNA的堿基組成具有種的特異性,但沒有組織和器官的特異性。另外,生長和發(fā)育階段`營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境的改變都不影響DNA的堿基組成。
DNA的雙螺旋(DNAdouble helix):一種核酸的構象,在該構象中,兩條反向平行的多核甘酸鏈相互纏繞形成一個右手的雙螺旋結構。堿基位于雙螺旋內(nèi)側,磷酸與糖基在外側,通過磷酸二脂鍵相連,形成核酸的骨架。堿基平面與假象的中心軸垂直,糖環(huán)平面則與軸平行,兩條鏈皆為右手螺旋。雙螺旋的直徑為2nm,堿基堆積距離為 0.34nm, 兩核甘酸之間的夾角是36゜,每對螺旋由10對堿基組成,堿基按A-T,G-C配對互補,彼此以氫鍵相聯(lián)系。維持DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定的力主要是堿基堆積力。雙螺旋表面有兩條寬窄`深淺不一的一個大溝和一個小溝。
大溝(major groove)和小溝(minor groove):繞B-DNA雙螺旋表面上出現(xiàn)的螺旋槽(溝),寬的溝稱為大溝,窄溝稱為小溝。大溝,小溝都、是由于堿基對堆積和糖-磷酸骨架扭轉造成的。
DNA超螺旋(DNAsupercoiling):DNA本身的卷曲一般是DNA雙`螺旋的彎曲欠旋(負超螺旋)或過旋(正超螺旋)的結果。
拓撲異構酶(topoisomerse):通過切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵,然后重新纏繞和封口來改變DNA連環(huán)數(shù)的酶。拓撲異構酶Ⅰ、通過切斷DNA中的一條鏈減少負超螺旋,增加一個連環(huán)數(shù)。某些拓撲異構酶Ⅱ也稱為DNA促旋酶。
核小體(nucleosome):用于包裝染色質(zhì)的結構單位,是由DNA鏈纏繞一個組蛋白核構成的。
染色質(zhì)(chromatin): 是存在與真核生物間期細胞核內(nèi),易被堿性染料著色的一種無定形物質(zhì)。染色質(zhì)中含有作為骨架的完整的雙鏈DNA,以及組蛋白`非組蛋白和少量的DNA。
染色體(chromosome):是染色質(zhì)在細胞分裂過程中經(jīng)過緊密纏繞`折疊`凝縮和精細包裝形成的具有固定形態(tài)的遺傳物質(zhì)存在形式。簡而言之,染色體是一個大的單一的雙鏈DNA分子與相關蛋白質(zhì)組成的復合物,DNA中含有許多貯存和傳遞遺傳信息的基因。
DNA變性(DNAdenaturation):DNA雙鏈解鏈,分離成兩條單鏈的現(xiàn)象。
退火(annealing):既DNA由單鏈復性、變成雙鏈結構的過程。來源相同的DNA單鏈經(jīng)退火后完全恢復雙鏈結構的過程,同源DNA之間`DNA和RNA之間,退火后形成雜交分子。
熔解溫度(melting temperature,Tm):雙鏈DNA熔解徹底變成單鏈DNA的溫度范圍的中點溫度。
增色效應(hyperchromic effect):當雙螺旋DNA熔解(解鏈)時,260nm處紫外吸收增加的現(xiàn)象。
減色效應(hypochromic effect):隨著核酸復性,紫外吸收降低的現(xiàn)象。
核酸內(nèi)切酶(exonuclease): 核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶中能夠水解核酸分子內(nèi)磷酸二酯鍵的酶。
核酸外切酶(exonuclease):從核酸鏈的一端逐個水解核甘酸的酶。
限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease):一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
限制酶圖譜(restriction map):同一DNA用不同的限制酶進行切割,從而獲得各種限制酶的切割位點,由此建立的位點圖譜有助于對DNA的結構進行分析。
反向重復序列(inverted repeat sequence):在同一多核甘酸內(nèi)的相反方向上存在的重復的核甘酸序列。在雙鏈DNA中反向重復可能引起十字形結構的形成。
重組DNA技術(recombination DNA technology):也稱之為基因工程(genomic engineering).利用限制性內(nèi)切酶和載體,按照預先設計的要求,將一種生物的某種目的基因和載體DNA重組后轉入另一生物細胞中進行復制`轉錄和表達的技術。
基因(gene):也稱為順反子(cistron).泛指被轉錄的一個DNA片段。在某些情況下,基因常用來指編碼一個功能蛋白或DNA分子的DNA片段。
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