2017臨床執(zhí)業(yè)助理醫(yī)師考試生物化學(xué)復(fù)習(xí)筆記第一章

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　　第一章 蛋白質(zhì)的化學(xué)

　　第一節(jié) 蛋白質(zhì)的分子組成

　　一、蛋白質(zhì)的元素組成

　　經(jīng)元素分析，主要有 C(50%～55%)、H(6%～7%)、O(19%～24%)、N(13%～19%)、S(0%～4%)。有些蛋白質(zhì)還含微量的P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I等。

　　各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。因此，可以用定氮法來推算樣品中蛋白質(zhì)的大致含量。

　　每克樣品含氮克數(shù)×6.25×100=100g樣品中蛋白質(zhì)含量(g%)

　　二、蛋白質(zhì)的基本組成單位——氨基酸

　　蛋白質(zhì)在酸、堿或蛋白酶的作用下，最終水解為游離氨基酸(amino acid)，即蛋白質(zhì)組成單體或構(gòu)件分子。存在于自然界中的氨基酸有300余種，但合成蛋白質(zhì)的氨基酸僅20種(稱編碼氨基酸)，最先發(fā)現(xiàn)的是天門冬氨酸(1806年)，最后鑒定的是蘇氨酸(1938年)。

　　(一)氨基酸的結(jié)構(gòu)通式

　　組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸有共同的結(jié)構(gòu)特點：

　　1.氨基連接在α- C上，屬于α-氨基酸(脯氨酸為α-亞氨基酸)。

　　2.R是側(cè)鏈，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。天然蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-型。

　　注意：構(gòu)型是指分子中各原子的特定空間排布，其變化要求共價鍵的斷裂和重新形成。旋光性是異構(gòu)體的光學(xué)活性，是使偏振光平面向左或向右旋轉(zhuǎn)的性質(zhì)，(-)表示左旋，(+)表示右旋。構(gòu)型與旋光性沒有直接對應(yīng)關(guān)系。

　　(二)氨基酸的分類

　　1.按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為脂肪族、芳香族、雜環(huán)、雜環(huán)亞氨基酸四類。

　　2.按R基的極性和在中性溶液的解離狀態(tài)分為非極性氨基酸、極性不帶電荷、極性帶負(fù)電荷或帶正電荷的四類。

　　帶有非極性R(烴基、甲硫基、吲哚環(huán)等，共9種)：甘(Gly)、丙(Ala)、纈(Val)、亮(Leu)、異亮(Ile)、苯丙(Phe)、甲硫(Met)、脯(Pro)、色(Trp)

　　帶有不可解離的極性R(羥基、巰基、酰胺基等，共6種)：絲(Ser)、蘇(Thr)、天胺(Asn)、谷胺(Gln)、酪(Tyr)、半(Cys)

　　帶有可解離的極性R基(共5種)：天(Asp)、谷(Glu)、賴(Lys)、精(Arg)、組(His)，前兩個為酸性氨基酸，后三個是堿性氨基酸。

　　蛋白質(zhì)分子中的胱氨酸是兩個半胱氨酸脫氫后以二硫鍵結(jié)合而成，膠原蛋白中的羥脯氨酸、羥賴氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白質(zhì)加工修飾而成。

　　(三)氨基酸的重要理化性質(zhì)

　　1.一般物理性質(zhì)

　　α-氨基酸為無色晶體，熔點一般在200 oC以上。各種氨基酸在水中的溶解度差別很大(酪氨酸不溶于水)。一般溶解于稀酸或稀堿，但不能溶解于有機溶劑，通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。

　　芳香族氨基酸(Tyr、Trp、Phe)有共軛雙鍵，在近紫外區(qū)有光吸收能力，Tyr、Trp的吸收峰在280nm，Phe在265 nm。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)含Tyr、Trp殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。

　　2.兩性解離和等電點(isoelectric point, pI)

　　氨基酸在水溶液或晶體狀態(tài)時以兩性離子的形式存在，既可作為酸(質(zhì)子供體)，又可作為堿(質(zhì)子受體)起作用，是兩性電解質(zhì)，其解離度與溶液的pH有關(guān)。

　　在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢和程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點。氨基酸的pI是由α-羧基和α-氨基的解離常數(shù)的負(fù)對數(shù)pK1和pK2決定的。計算公式為：pI=1/2(pK1+ pK2)。

　　若1個氨基酸有3個可解離基團，寫出它們電離式后取兼性離子兩邊的pK值的平均值，即為此氨基酸的等電點(酸性氨基酸的等電點取兩羧基的pK值的平均值，堿性氨基酸的等電點取兩氨基的pK值的平均值)。

　　3.氨基酸的化學(xué)反應(yīng)

　　氨基酸的化學(xué)反應(yīng)是其基團的特征性反應(yīng)。重要的有：

　　(1)茚三酮反應(yīng)

　　所有具有自由α-氨基的氨基酸與過量茚三酮共熱形成藍(lán)紫色化合物(脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì))。用分光光度法可定量測定微量的氨基酸。藍(lán)紫色化合物的最大吸收峰在570nm波長處，黃色在440nm波長下測定。吸收峰值的大小與氨基酸釋放的氨量成正比。

　　(2)與2，4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)

　　在弱堿性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易與DNFB作用生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯氨基酸(DNP-氨基酸)，這一反應(yīng)在蛋白質(zhì)化學(xué)的研究史上起過重要作用，Sanger等人應(yīng)用它測定胰島素一級結(jié)構(gòu)。

　　多肽順序自動分析儀是根據(jù)相類似的原理設(shè)計的，即利用多肽鏈N端氨基酸的α-氨基與異硫氰酸苯酯PITC反應(yīng)(Edman降解法)。

　　三、肽(peptide)

　　1.肽鍵與肽鏈

　　一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水形成的酰胺鍵稱為肽鍵。由氨基酸通過肽鍵相連而成的化合物稱為肽。肽鍵及其兩端的α-碳原子相連所形成的長鏈骨架，即…Cα—C—N—Cα—C—N—Cα—C—N—Cα…稱為多肽主鏈，—CαCN—是重復(fù)單位。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中的主要共價鍵。多肽鏈的方向性是從N末端指向C末端。

　　肽分子中不完整的氨基酸稱為氨基酸殘基。肽按其序列從N端到C端命名。一般10肽以下屬寡肽，10肽以上為多肽。

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　　2.生物活性肽

　　(1)谷胱甘肽(glutathione，GSH)

　　是由Glu、Cys、Gly組成的一種三肽，又叫γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸(含γ-肽鍵)。Cys的-SH是主要功能基團，GSH是一種抗氧化劑，是某些酶的輔酶，可保護蛋白質(zhì)分子中的-SH免遭氧化，保護巰基蛋白和酶的活性。在GSH過氧化物酶的作用下，GSH還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，生成H2O，2分子GSH被氧化成GSSG，后者在GSH還原酶催化下，又生成GSH。

　　(2)多肽類激素和神經(jīng)肽

　　人體內(nèi)有許多激素屬寡肽或多肽，如下丘腦—垂體分泌的催產(chǎn)素(9肽)、加壓素(9肽)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH，39肽)等。催產(chǎn)素和加壓素結(jié)構(gòu)僅第3、第8位兩個氨基酸殘基不同，前者使平滑肌收縮，有催產(chǎn)和使乳腺泌乳的作用;后者能使小動脈收縮，增高血壓，也有減少排尿的作用。

　　神經(jīng)肽是在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的肽類。如腦啡肽(5肽)、β-內(nèi)啡肽(31肽)、強啡肽(17肽)等。隨著腦科學(xué)的發(fā)展，會發(fā)現(xiàn)更多的生物活性肽。

　　第二節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

　　蛋白質(zhì)是生物大分子，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，人們用4個層次來描述，包括蛋白質(zhì)的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)描述的是蛋白質(zhì)的線性(或一維)結(jié)構(gòu)，即共價連接的氨基酸殘基的序列，又稱初級或化學(xué)結(jié)構(gòu)。二級以上的結(jié)構(gòu)稱高級結(jié)構(gòu)或構(gòu)象(conformation)。

　　一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primary structure)

　　1953年，英國科學(xué)家F. Sanger首先測定了胰島素(insulin)的一級結(jié)構(gòu)，有51個氨基酸殘基，由一條A鏈和一條B鏈組成，分子中共有3個二硫鍵，其中兩個在A、B鏈之間，另一個在A鏈內(nèi)。

　　蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定或稱序列分析常用的方法是Edman降解和重組DNA法。Edman降解是經(jīng)典的化學(xué)方法，比較復(fù)雜。首先要純化一定量的待測蛋白質(zhì)，分別作分子量測定、氨基酸組成分析、N-末端分析、C-末端分析;要應(yīng)用不同的化學(xué)試劑或特異的蛋白內(nèi)切酶水解將蛋白質(zhì)裂解成大小不同的肽段，測出它們的序列，對照不同水解制成的兩套肽段，找出重疊片段，最后推斷蛋白質(zhì)的完整序列。重組DNA法是基于分子克隆的分子生物學(xué)方法，比較簡單而高效，不必先純化該種蛋白質(zhì)，而是先要得到編碼該種蛋白質(zhì)的基因(DNA片段)，測定DNA中核苷酸的序列，再按三個核苷酸編碼一個氨基酸的原則推測蛋白質(zhì)的完整序列。這兩種方法可以相互印證和補充。

　　目前，國際互聯(lián)網(wǎng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫已有3千多種一級結(jié)構(gòu)清楚。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。

　　二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)

　　蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指其分子中主鏈原子的局部空間排列，是主鏈構(gòu)象(不包括側(cè)鏈R基團)。

　　構(gòu)象是分子中原子的空間排列，但這些原子的排列取決于它們繞鍵的旋轉(zhuǎn)，構(gòu)象不同于構(gòu)型，一個蛋白質(zhì)的構(gòu)象在不破壞共價鍵情況下是可以改變的。但是蛋白質(zhì)中任一氨基酸殘基的實際構(gòu)象自由度是非常有限的，在生理條件下，每種蛋白質(zhì)似乎是呈現(xiàn)出稱為天然構(gòu)象的單一穩(wěn)定形狀。

　　20世紀(jì)30年代末，L.Panling 和R.B.Corey應(yīng)用X射線衍射分析測定了一些氨基酸和寡肽的晶體結(jié)構(gòu)，獲得了一組標(biāo)準(zhǔn)鍵長和鍵角，提出了肽單元(peptide unit)的概念, 還提出了兩種主鏈原子的局部空間排列的分子模型(α-螺旋)和(β-折疊)。

　　1.肽單位

　　肽鍵及其兩端的α-C共6個原子處于同一平面上，組成了肽單位(所在的平面稱肽鍵平面)。

　　肽鍵C—N鍵長為0.132nm，比相鄰的單鍵(0.147nm)短，而較C=N雙鍵(0.128nm)長，有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵平面上各原子呈順反異構(gòu)關(guān)系，肽鍵平面上的O、H以及2個α-碳原子為反式構(gòu)型(trans configuration)。

　　主鏈中的Cα—C和Cα—N單鍵可以旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)角φ、ψ決定了兩個相鄰的肽鍵平面相對關(guān)系。由于肽鍵平面的相對旋轉(zhuǎn)，使主鏈可以以非常多的構(gòu)象出現(xiàn)。事實上，肽鏈在構(gòu)象上受到很大限制，因為主鏈上有1/3不能自由旋轉(zhuǎn)的肽鍵，另外主鏈上有很多側(cè)鏈R的影響。蛋白質(zhì)的主鏈骨架由許多肽鍵平面連接而成。

　　2.α-螺旋(α-helix)

　　α-螺旋是肽鍵平面通過α-碳原子的相對旋轉(zhuǎn)形成的一種緊密螺旋盤繞，是有周期的一種主鏈構(gòu)象。其特點是：

　�、� 螺旋每轉(zhuǎn)一圈上升3.6個氨基酸殘基，螺距約0.54nm(每個殘基上升0.15nm，旋轉(zhuǎn)100O)。

　　② 相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。典型α-螺旋一對氫鍵O與N之間共有13個原子(3.613)，前后間隔3個殘基。

　　③螺旋的走向絕大部分是右手螺旋，殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)。R基團的大小、荷電狀態(tài)及形狀均對α-螺旋的形成及穩(wěn)定有影響。

　　3.β-折疊(β-pleated sheet)

　　β-折疊是一種肽鏈相當(dāng)伸展的周期性結(jié)構(gòu)。

　�、� 相鄰肽鍵平面間折疊成110O角，呈鋸齒狀。

　�、� 兩個以上具β-折疊的肽鏈或同一肽鏈內(nèi)不同肽段相互平行排列，形成β-折疊片層，其穩(wěn)定因素是肽鏈間的氫鍵。

　�、� 逆向平行的片層結(jié)構(gòu)比順向平行的穩(wěn)定。

　　α-螺旋和β-折疊是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式。毛發(fā)中的α-角蛋白和蠶絲中的絲心蛋白是其典型，在許多球蛋白中也存在，但所占比例不一樣。

　　膠原蛋白中存在的螺旋結(jié)構(gòu)不同于一般的α-螺旋，是由3條具有左手螺旋的鏈相互纏繞形成右手超螺旋分子。鏈間氫鍵以及螺旋和超螺旋的反向盤繞維持其穩(wěn)定性。

　　4.β-轉(zhuǎn)角(β-turn)

　　為了緊緊折疊成球蛋白的緊密形狀，多肽鏈180O回折成發(fā)夾或β-轉(zhuǎn)角。其處由4個連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成，常有Gly和Pro存在，穩(wěn)定β-轉(zhuǎn)角的作用力是第一個氨基酸殘基羰基氧(O)與第四個氨基酸殘基的氨基氫(H)之間形成的氫鍵。β-轉(zhuǎn)角常見于連接反平行β-折疊片的端頭。

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　　5.無規(guī)卷曲(random coil)

　　多肽鏈的主鏈呈現(xiàn)無確定規(guī)律的卷曲。典型球蛋白大約一半多肽鏈?zhǔn)沁@樣的構(gòu)象。

　　6.超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

　　超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)二級至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象。

　　超二級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)中兩個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段在空間上相互接近，形成一特殊的組合體，又稱為模體(motif)。通常有αα，ββ，βαβ等，例如鈣結(jié)合蛋白質(zhì)中的螺旋-環(huán)-螺旋模序及鋅指結(jié)構(gòu)。

　　結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位，是在超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步繞曲折疊有獨特構(gòu)象和部分生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)。對于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基，結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)是一個意思，即這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域的;對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上的相對獨立的結(jié)構(gòu)域締合成三級結(jié)構(gòu)。

　　三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)

　　指一條多肽鏈中所有原子的整體排布，包括主鏈和側(cè)鏈。維系三級結(jié)構(gòu)的作用力主要是次級鍵(疏水相互作用、靜電力、氫鍵等)。在序列中相隔較遠(yuǎn)的氨基酸疏水側(cè)鏈相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合蛋白質(zhì)的輔基往往鑲嵌其內(nèi)，形成功能活性部位，而親水基團則在外，這也是球狀蛋白質(zhì)易溶于水的原因。1963年Kendrew等從鯨肌紅蛋白的X射線衍射圖譜測定它的三級結(jié)構(gòu)(153個氨基酸殘基和一個血紅素輔基，相對分子質(zhì)量為17800)。由A→H 8段α-螺旋盤繞折疊成球狀，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部形成一個袋形空穴，血紅素居于其中，富有極性及電荷的則在分子表面形成親水的球狀蛋白。

　　四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) (quaternary structure)

　　有些蛋白質(zhì)的分子量很大，由2條或2條以上具有獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價鍵相互結(jié)合而成，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。構(gòu)成四級結(jié)構(gòu)的每條多肽鏈稱為亞基 (subunit)，亞基單獨存在時一般沒有生物學(xué)功能，構(gòu)成四級結(jié)構(gòu)的幾個亞基可以相同或不同。如血紅蛋白(hemoglobin,Hb) 是由兩個α-亞基和兩個β-亞基形成的四聚體(α2β2)。

　　五、蛋白質(zhì)分子中的化學(xué)鍵

　　蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是由共價鍵形成的，如肽鍵和二硫鍵。而維持空間構(gòu)象穩(wěn)定的是非共價的次級鍵。如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華引力等。

　　第三節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

　　一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

　　(一)一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)

　　20世紀(jì)60年代初，美國科學(xué)家C.Anfinsen進行牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性實驗，提出了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的命題。

　　核糖核酸酶由124個氨基酸殘基組成，有4對二硫鍵。用尿素和β-巰基乙醇處理該酶溶液，分別破壞次級鍵和二硫鍵，肽鏈完全伸展，變性的酶失去催化活性;當(dāng)用透析方法去除變性劑后，酶活性幾乎完全恢復(fù)，理化性質(zhì)也與天然的酶一樣。

　　概率計算表明，8個半胱氨酸殘基結(jié)合成4對二硫鍵，可隨機組合成105種配對方式，而事實上只形成了天然酶的構(gòu)象，這說明一級結(jié)構(gòu)未破壞，保持了氨基酸的排列順序就可能回復(fù)到原來的三級結(jié)構(gòu)，功能依然存在。

　　(二)種屬差異

　　大量實驗結(jié)果證明，一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間結(jié)構(gòu)和功能也相似，不同種屬的同源蛋白質(zhì)有同源序列，反映其共同進化起源，通過比較可以揭示進化關(guān)系。

　　例如哺乳動物的胰島素，其一級結(jié)構(gòu)僅個別氨基酸差異(A鏈5、6、10位，B鏈30位)，它們對生物活性調(diào)節(jié)糖代謝的生理功能不起決定作用。

　　從各種生物的細(xì)胞色素C(cytochrome c ) 的一級結(jié)構(gòu)分析，可以了解物種進化間的關(guān)系。進化中越接近的生物，它們的細(xì)胞色素c的一級結(jié)構(gòu)越近似。

　　(三)分子病

　　分子病是指機體DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子異常和蛋白質(zhì)生物合成的異常，進而導(dǎo)致機體某些功能和結(jié)構(gòu)隨之變異的遺傳病。在1904年，發(fā)現(xiàn)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病。大約化費了40多年才清楚患病原因，患者的血紅蛋白(HbS)與正常人的(HbA)相比，僅β-鏈的第6位上，Val取代了正常的Glu。目前全世界已發(fā)現(xiàn)有異常血紅蛋白400種以上。

　　二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

　　蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，空間結(jié)構(gòu)變化，其功能也隨之改變。肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)是典型的例子。

　　肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)都能與氧進行可逆的結(jié)合，氧結(jié)合在血紅素輔基上。然而Hb是四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運氧;Mb是單體，可以儲存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地擴散。它們的氧合曲線不同，Mb為一條雙曲線，Hb是一條 S型曲線。在低p(O2)下，肌紅蛋白比血紅蛋白對氧親和性高很多，p(O2)為2.8torr(1torr≈133.3Pa)時，肌紅蛋白處于半飽和狀態(tài)。在高p(O2)下，如在肺部(大約100torr)時，兩者幾乎都被飽和。其差異形成一個有效的將氧從肺轉(zhuǎn)運到肌肉的氧轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

　　Hb未與氧結(jié)合時，其亞基處于一種空間結(jié)構(gòu)緊密的構(gòu)象(緊張態(tài)，T型)，與氧的親和力小。只要有一個亞基與氧結(jié)合，就能使4個亞基間的鹽鍵斷裂，變成松弛的構(gòu)象(松弛態(tài)，R型)。T型和R型的相互轉(zhuǎn)換對調(diào)節(jié)Hb運氧的功能有重要作用。一個亞基與其配體結(jié)合后能促進另一亞基與配體的結(jié)合是正協(xié)同效應(yīng)，其理論解釋是Hb是別構(gòu)蛋白，有別構(gòu)效應(yīng)。

　　第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

　　蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和氨基酸相似，有兩性解離及等電點、紫外吸收和呈色反應(yīng)。作為生物大分子，還有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點。要了解和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系就要利用其特殊的理化性質(zhì)，采取鹽析、透析、電泳、層析及離心等不損傷蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的物理方法分離純化蛋白質(zhì)。

　　一、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì)

　　蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量在1萬~100萬，其顆粒平均直徑約為4.3 nm(膠粒范圍是1~100nm)。準(zhǔn)確可靠的測定方法是超離心法，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可用沉降系數(shù)(S)表示。

　　在球狀蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)形成時，親水基團位于分子表面，在水溶液中與水起水合作用，因此，蛋白質(zhì)的水溶液具有親水膠體的性質(zhì)。顆粒表面的水化膜和電荷是其穩(wěn)定的因素，調(diào)節(jié)pH至pI、加入脫水劑等，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。

　　透析法是利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，去掉小分子物質(zhì)，達到純化的目的。

　　大小不同的蛋白質(zhì)分子可以通過凝膠過濾分開。又稱分子篩層析。

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　　二、蛋白質(zhì)的兩性解離

　　蛋白質(zhì)和氨基酸一樣是兩性電解質(zhì)，在溶液中的荷電狀態(tài)受pH值影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點。pH>pI時，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。在人體體液中多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點接近pH5，所以在生理pH7.4環(huán)境下，多數(shù)蛋白質(zhì)解離成陰離子。少量蛋白質(zhì)，如魚精蛋白、組蛋白的pI偏于堿性，稱堿性蛋白質(zhì)，而胃蛋白酶和絲蛋白為酸性蛋白。

　　三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固

　　蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用下，空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致理化性質(zhì)改變，生物學(xué)活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。

　　蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是多肽鏈從卷曲到伸展的過程，不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變(如加熱破壞氫鍵，酸堿破壞鹽鍵等)。變性作用不過于劇烈，是一種可逆反應(yīng)，去除變性因素，有些蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象和功能可恢復(fù)或部分恢復(fù)，稱為復(fù)性(denaturation)。

　　蛋白質(zhì)變性的主要表現(xiàn)是失去生物學(xué)活性，如酶失去催化能力、血紅蛋白失去運輸氧的功能、胰島素失去調(diào)節(jié)血糖的生理功能等。變性蛋白溶解度降低，易形成沉淀析出;易被蛋白水解酶消化。蛋白質(zhì)變性具有重要的實際意義。

　　蛋白質(zhì)自溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的沉淀。鹽析、有機溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑都可沉淀蛋白質(zhì)。鹽析沉淀蛋白質(zhì)不變性，是分離制備蛋白質(zhì)的常用方法。如血漿中的清蛋白在飽和的硫酸銨溶液中可沉淀，而球蛋白則在半飽和硫酸銨溶液中發(fā)生沉淀。乙醇、丙酮均為脫水劑，可破壞水化膜，降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)的解離程度降低，表面電荷減少，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出。低溫時，用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，可保留原有的生物學(xué)活性。但用乙醇，時間較長則會導(dǎo)致變性。重金屬鹽(Hg2+、Cu2+、Ag+)，生物堿(如三彔乙酸、苦味酸、鞣酸)與蛋白質(zhì)結(jié)合成鹽而沉淀，是不可逆的。

　　蛋白質(zhì)變性不一定沉淀(如強酸、強堿作用變性后仍然能溶解于強酸、強堿溶液中，將pH調(diào)至等電點，出現(xiàn)絮狀物，仍可溶解于強酸、強堿溶液，加熱則變成凝塊，不再溶解)。凝固是蛋白質(zhì)變性發(fā)展的不可逆的結(jié)果。沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性(如鹽析)。

　　四、蛋白質(zhì)的紫外吸收和呈色反應(yīng)

　　蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸，在280nm波長處有特征性吸收峰，用于定量測定。

　　蛋白質(zhì)分子中的多種化學(xué)基團具有特定的化學(xué)性能，與某些試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)，可用于定性、定量分析。如蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，在堿性溶液與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物(雙縮脲反應(yīng))。酪氨酸含酚基，與米倫試劑生成白色沉淀，加熱后變紅色。Folin-酚試劑與酪氨酸反應(yīng)生成藍(lán)色。色氨酸與乙醛酸反應(yīng)，慢慢注入濃硫酸，出現(xiàn)紫色環(huán)。

　　第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分類

　　自然界蛋白質(zhì)分布廣泛，種類繁多，有1012~1013種。目前仍無法按蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行精確的分類，一般按蛋白質(zhì)的分子形狀、分子組成、生物功能進行分類。

　　1.按分子形狀分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。

　　2.按分子組成分為簡單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)。

　　簡單蛋白質(zhì)完全水解的產(chǎn)物僅為α-氨基酸。這類蛋白質(zhì)按其溶解度等理化性質(zhì)分為7類。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、組蛋白和硬蛋白。

　　結(jié)合蛋白質(zhì)由簡單蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)(輔基)組成。根據(jù)輔基的不同，這類蛋白質(zhì)可分為5類。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和磷蛋白。

　　細(xì)胞核中的核蛋白是DNA與組蛋白結(jié)合而成，細(xì)胞質(zhì)中的核糖體是RNA與蛋白質(zhì)組成的，已知的病毒也是核蛋白。免疫球蛋白是一類糖蛋白，由蛋白質(zhì)與糖以共價鍵相連而成;脂蛋白由蛋白質(zhì)與脂類通過非共價鍵相連，存在生物膜和動物血漿中。

　　3.按蛋白質(zhì)功能分為活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì)。

　　活性蛋白質(zhì)包括有催化功能的酶、有調(diào)節(jié)功能的激素、有運動、防御、接受和傳遞信息的蛋白質(zhì)以及毒蛋白、膜蛋白等。膠原、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等是非活性蛋白質(zhì)。

　　例題：

　　1、在寡聚蛋白質(zhì)中，亞基間的立體排布、相互作用以及接觸部位間的空間結(jié)構(gòu)稱之謂( )

　　A、三級結(jié)構(gòu) B、締合現(xiàn)象 C、四級結(jié)構(gòu) D、變構(gòu)現(xiàn)象

　　2、形成穩(wěn)定的肽鏈空間結(jié)構(gòu)，非常重要的一點是肽鍵中的四個原子以及和它相鄰的兩個α-碳原子處于( )

　　A、不斷繞動狀態(tài) B、可以相對自由旋轉(zhuǎn) C、同一平面 D、隨不同外界環(huán)境而變化的狀態(tài)

　　3、破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基之一是：( )

　　A、亮氨酸 B、丙氨酸 C、脯氨酸 D、谷氨酸

　　4、肽鏈中的肽鍵大都是：( )

　　A、順式結(jié)構(gòu) B、順式和反式共存 C、反式結(jié)構(gòu)

　　參考答案

　　1. C 2.C 3.C 4.C

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