2013年初級檢驗(yàn)技師考試：HLA細(xì)胞法分型試驗(yàn)

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　　HLA-D和DP位點(diǎn)的抗原須用細(xì)胞法分型進(jìn)行鑒定，所以又稱LD抗原(lymphocytedefinedantigen)，其鑒定方法普遍采用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixedlymphocyteculture，MLC)，也稱混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixedlymphocytereaction，MLR)。

　　1.試驗(yàn)方法將分離的反應(yīng)細(xì)胞(通常是患者的淋巴細(xì)胞)與刺激細(xì)胞(通常是供者或已知的標(biāo)準(zhǔn)淋巴細(xì)胞)配制成1×106/ml濃度的懸液，各加 0.2ml到反應(yīng)管中;放置37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)5～6天。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行涂片染色，觀察并計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞;也可在培養(yǎng)結(jié)束前5～12小時(shí)加入3H-TdR，收獲后用液體閃爍儀計(jì)數(shù)細(xì)胞的放射性。試驗(yàn)結(jié)果的常用表示方式是刺激指數(shù)(SI)。

　　MLC分為雙向法和單向法。雙向MLC是反應(yīng)管中兩種細(xì)胞都有應(yīng)答能力，可以互為刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果是兩種細(xì)胞反應(yīng)之和。

　　SI=2×試驗(yàn)管cpm/(A對照cpm+B對照cpm)

　　雙向MLC只能反映兩種細(xì)胞間LD的差別，結(jié)果比較模糊，也不能做LD抗原的分型。單向MLC是將刺激細(xì)胞用絲裂霉素 C(mitomycinC)或X線照射先行滅活，但細(xì)胞的抗原性保持不變，因此可作為刺激細(xì)胞而不能作為反應(yīng)細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果是待檢測細(xì)胞的反應(yīng)，使于結(jié)果分析。

　　SI=試驗(yàn)管cpm/自身對照cpm

　　單向MLC可以用來進(jìn)行HLD-D和DP位點(diǎn)的分型試驗(yàn)，常用的方法有兩類：純合子分型細(xì)胞(homozygoustypingcell，HTC)試驗(yàn)和預(yù)敏淋巴細(xì)胞分型(primedlymphocytetyping，PLT)試驗(yàn)。

　　2.HTC試驗(yàn)HTC是指細(xì)胞內(nèi)一對同源染色體上兩個(gè)HLA單倍型完全相同，所以該位點(diǎn)在細(xì)胞表面只表達(dá)一種抗原;HTC可從近親婚配的子代表中尋找。將一組HTC經(jīng)處理來活后作為刺激細(xì)胞，與待檢細(xì)胞做單向MLC。如果待檢細(xì)胞與刺激細(xì)胞的LD不同，就會(huì)發(fā)生反應(yīng);如果相同便不反應(yīng);所以試驗(yàn)又稱為陰性分型法。當(dāng)SI≤2時(shí)可認(rèn)為待檢細(xì)胞與該管HTC的LD抗原相同。本法的缺點(diǎn)是HTC難以得到，而且培養(yǎng)時(shí)間長(5～6天)，在尸體器官移植時(shí)不能應(yīng)用。

　　3.PLT試驗(yàn)本方法需事先準(zhǔn)備分型細(xì)胞：選擇只有一個(gè)單倍型相同的兩個(gè)體a/b和a/c(這在雙親與子女之間不難做到)，取前者的淋巴細(xì)胞處理后作刺激細(xì)胞，取后者的淋巴細(xì)胞作反應(yīng)細(xì)胞;將兩者進(jìn)行單向混合培養(yǎng)，至第10天使可得到針對b單倍型有特異性免疫應(yīng)答能力的預(yù)致敏分型細(xì)胞(PTL)。依此類推，可以制備出一系列能識別各種已知LD抗原的一套PTL;這些處于休止?fàn)顟B(tài)的致敏記憶細(xì)胞可在液氮中長期保存?zhèn)溆谩?/P>

　　進(jìn)行PLT試驗(yàn)時(shí)，需將待檢淋巴細(xì)胞處理成刺激細(xì)胞，而PTL為反應(yīng)細(xì)胞;如果待檢細(xì)胞的LD抗原與PTL預(yù)先識別的特異性相同，則PTL會(huì)迅速出現(xiàn)反應(yīng)(二次應(yīng)答)，如不同則不出現(xiàn)快速反應(yīng)，所以本法又稱為陽性分型法。PLT法克服了HTC法試驗(yàn)周期長的缺點(diǎn)，在24小時(shí)內(nèi)即可報(bào)出結(jié)果;PTL比HTC容易得到，但真正做起來也復(fù)雜。

　　不管是CDC試驗(yàn)還是MIC方法，都必須以受檢者的淋巴細(xì)胞作為檢測標(biāo)本，這就大大地限制了檢測方法的應(yīng)用范圍;而且還存在抗體來源困難、細(xì)胞培養(yǎng)周期過長等缺點(diǎn);所以近年來將分子生物學(xué)技術(shù)引入了HLA檢測的領(lǐng)域，產(chǎn)生了DNA分型法。DNA分型法是利用PCR技術(shù)將標(biāo)本中的少量目的DNA大量擴(kuò)增，然后再進(jìn)行產(chǎn)物鑒定的方法(原理和步驟在此不予討論)，特點(diǎn)是靈敏度高，試劑來源容易，應(yīng)用范圍廣，陳舊的或微量的標(biāo)本都可進(jìn)行檢測，在移植醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)和其他方面都有廣闊的前途。

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