2013年初級(jí)檢驗(yàn)技士免疫檢驗(yàn)：斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)

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　　斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)的基本原理是：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過(guò)性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過(guò)膜的方式迅速完成。斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)最初是從斑點(diǎn)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)建立的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標(biāo)記的，稱為斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗(yàn)。90年代初發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物的斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)(dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA)，又名滴金免疫測(cè)定法(簡(jiǎn)稱滴金法)。在滴金法中不需酶對(duì)底物的反應(yīng)，更加簡(jiǎn)便、快速，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用日漸廣泛。

　　(一)原理

　　以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過(guò)膜時(shí)，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無(wú)關(guān)蛋白等沒(méi)濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽(yáng)性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。

　　(二)試劑和操作

　　1.滲濾裝置滲濾裝置是滴金法測(cè)定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點(diǎn)加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.4～0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對(duì)盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對(duì)盒的圓孔下，緊密關(guān)閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置(圖19-1)。塑料小盒的形狀最多見(jiàn)的是扁平的長(zhǎng)方形小板，加之滴金法的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程都是在滲濾裝置上進(jìn)行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應(yīng)板。

　　2.試劑盒組成滴金法試劑盒的三個(gè)基本試劑成分是滴金法反應(yīng)板、免疫金復(fù)合和洗滌液。為了提供質(zhì)控保證，用于抗原測(cè)定的試劑盒還應(yīng)包括抗原參照品，相應(yīng)的檢測(cè)抗體的試劑盒應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照品。

　　3.測(cè)定操作以雙抗體夾心法為例，具體步驟如下：

　　(1)將反應(yīng)板平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，于小孔內(nèi)滴加血清標(biāo)本1～2滴，待完全滲入。

　　(2)于小孔內(nèi)滴加免疫金復(fù)合物試劑1～2滴，待完全滲入。

　　(3)于小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入。

　　(4)判讀結(jié)果：在膜中央有清晰的淡紅色斑點(diǎn)顯示者判為陽(yáng)性反應(yīng);反之，則為陰性反應(yīng)。斑點(diǎn)呈色的深淺相應(yīng)地提示陽(yáng)性強(qiáng)度。

　　(三)質(zhì)量控制

　　滴金法的質(zhì)量控制常采用在硝酸纖維素膜上點(diǎn)加質(zhì)控點(diǎn)的方法。質(zhì)控小圓點(diǎn)多位于反應(yīng)斑點(diǎn)的正下方。雙抗體夾心法的質(zhì)控點(diǎn)最好是相應(yīng)抗原，若該抗原試劑不易制備或價(jià)格昂貴時(shí)，也可用SPA或針對(duì)金標(biāo)抗體的抗抗體來(lái)充當(dāng)。間接法的質(zhì)控點(diǎn)采用鹽析法粗提的人IgG最為經(jīng)濟(jì)、方便。

　　有將包被斑點(diǎn)由圓點(diǎn)改成短線條式的：質(zhì)控斑點(diǎn)橫向包被成橫線條，如“-”;反應(yīng)斑點(diǎn)縱向包被成豎線條，如“ㄏ”;兩者相交成“+”。這樣，陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果在膜上顯示紅色的正號(hào)(+)，陰性反應(yīng)結(jié)果則為負(fù)號(hào)(-)，目視判斷直觀、明了。

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