分子生物學(xué)筆記 第二章 DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組

第一節(jié) DNA的復(fù)制(DNA Replication)

一、DNA復(fù)制的基本特性 1. 半保留性(Semi-Conservative) Meselson-Stahl實驗 2. 雙向復(fù)制(一般) 復(fù)制起始點(origin)+兩側(cè)復(fù)制叉=復(fù)制單位(復(fù)制子, Replicon) 3.半不連續(xù)性(Semi-discontinuous) 前導(dǎo)鏈(leading strand)-連續(xù)合成隨從鏈(Lagging Strand)-不連續(xù),由崗崎片段(okazaki fragment)連接而成.

二、DNA復(fù)制必需的成份(真核生物) 1.染色體DNA復(fù)制必需三種核苷酸序列①復(fù)制起點②著絲粒③端粒. 2． RNA引物(RNA Primer) 一般8-14nt.帶游離3 -OH末端. 3.參加DNA復(fù)制的主要酶和蛋白質(zhì) ① DNA聚合酶(DNA Polymerase) 真核DNA復(fù)制的主要酶DNA Pol a/δ. 功能:從5 -3 方向延伸與模板互補(bǔ)的子代鏈. ②引發(fā)酶(Primase) 與其他多種蛋白組成多蛋白復(fù)合體-引發(fā)體(Primosome).催化RNA引物合成和復(fù)制起始. ③DNA連接酶(DNA Ligase) 催化一個雙鏈DNA的5 磷酸與另一雙鏈DNA的3 -OH形成磷酸二酯鍵. ④DNA解鏈酶(DNA Helicase),打開DNA雙鏈. ⑤增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen.PCNA) 輔助催化前導(dǎo)鏈合成. ⑥端粒酶(Telomerase) 末端復(fù)制問題。 端粒酶負(fù)責(zé)染色體末端(端粒)復(fù)制,是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒復(fù)制的模板.(因此端粒是逆轉(zhuǎn) 錄酶) 作用:維持端粒長度. 端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telomerase repeat amplification protocol）法測定（Kim,N et al.,science,266,2011-2014(1994) 端粒與細(xì)胞壽命。端粒、端粒酶與腫瘤的關(guān)系：絕大多數(shù)惡性腫瘤具有端粒酶活性但端?？s短，但也有約5%的腫瘤無端粒酶活性且端粒 較長。端粒酶作為新的腫瘤標(biāo)志和腫瘤治療靶點.

第二節(jié) DNA修復(fù)（DNA repair） DNA修復(fù)是維持基因組完整性的重要機(jī)制，在保護(hù)基因組避免發(fā)生可能導(dǎo)致腫瘤或遺傳疾病的突變中起關(guān)鍵的作用。引起DNA損傷的 因素： 1、 細(xì)胞內(nèi)源性損傷因素： DNA復(fù)制錯誤；自發(fā)損傷包括堿基互變異構(gòu)、堿基脫氨（C→U、A→I）和堿基丟失等；氧化代謝副產(chǎn)物如活性氧物質(zhì)（React ive oxygen species，ROS）的攻擊等。 2、 環(huán)境中的損傷因素：輻射（含紫外線、X射線）產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體；化學(xué)致癌物（氧化脫氨，烷化劑或代謝活化物如苯并芘、黃曲霉素 等產(chǎn)生堿基加合物）一、堿基切除修復(fù)(Base excision repair、BER) 該途徑中最關(guān)鍵的是必須通過一種糖苷酶(glycosylase)先除去變異堿基(如被氧化、烷基化或脫氨的堿基)，該糖苷酶催 化連接損傷堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵水解，釋放游離堿基并在DNA中產(chǎn)生一個去堿基位點，然后由去嘌呤／去嘧啶(AP)核酸內(nèi) 切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等利用相對的一條正常鏈為模板進(jìn)行修補(bǔ)合成。 BER途徑中的重要糖苷酶： (1)尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)，從DNA中除去尿嘧啶堿基； (2)3―甲基腺嘌吟(3MeA)DNA糖苷酶，可修復(fù)烷化劑產(chǎn)生的損傷； (3)負(fù)責(zé)修復(fù)DNA氧化損傷的糖苷酶（如Fpg／MutM DNA糖苷酶） BER是修復(fù)內(nèi)源性DNA損傷(自發(fā)水解、烷基化和活性氧攻擊)的主要途徑，因此對于降低自發(fā)突變的頻率、防止腫瘤發(fā)生有重要作 用。二、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair，NER) 首先由多聚體復(fù)合物識別損傷，再在損傷的兩側(cè)進(jìn)行切除。隨著DNA鏈被解開，包含損傷的單鏈片段釋放出來，留下的缺口由DNA聚 合酶填補(bǔ)，DNA連接酶封閉。該途徑包括20種以上蛋白，可以修復(fù)紫外輻射誘導(dǎo)的環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和(6―4)光產(chǎn)物 ((6―4)PPs)，以及一些化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的大加合物。人的NER系統(tǒng)有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能。 NER系統(tǒng)缺陷與著色性干皮病（Xeroderm pigmentosum,XP） NER可再分為二條子途徑： (1)全基因組修復(fù)(Global Genomic repair，GGR)途徑：修復(fù)整個基因組內(nèi)的損傷，其效率取決于損傷的化學(xué)特性、損傷部位的DNA序列和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。 (2)轉(zhuǎn)錄藕聯(lián)修復(fù)(Trancsription―coupled repair，TCR，)：特異地修復(fù)基因組中具有轉(zhuǎn)錄活性(即表達(dá))的基因的被轉(zhuǎn)錄DNA鏈上的損傷，該途徑的 特點是依賴RNA聚合酶II催化的轉(zhuǎn)錄，其中的一些蛋白是普通轉(zhuǎn)錄因子TFIIH 的亞基。三、錯配修復(fù)(Mismatch repair) 負(fù)責(zé)修復(fù)DNA復(fù)制過程中由于錯誤摻入而產(chǎn)生的錯配。 STR序列復(fù)制-模板鏈的滑動產(chǎn)生小的環(huán)狀突出(loop)- 重復(fù)序列擴(kuò)張（expansion）或丟失：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability） E coli中的MMR途徑需要mutS,mutH,mutL和uvrD基因產(chǎn)物和特異性核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等 。在酵母和人類已鑒定了mutS,mutH的多種同源物。遺傳性非息肉性結(jié)腸癌（HNPCC）基因缺陷。微衛(wèi)性不穩(wěn)定與腫瘤。新 的腫瘤基因診斷標(biāo)志。四、重組修復(fù)(Recomhinant repair) 修復(fù)DNA的兩條鏈均受損傷的部位的雙鏈斷裂或鏈間交連。 Further readings: 1 Wood RD，DNA repair in eukaryotes，Ann Rev Biochem，1996，65：135―167 2 Krokan HE,et a1., DNA glycosylase in the base excision repair of DNA．Biochem J，1997，325：1―16 3 Vrieling H，et a1., Transcription coupled repair and its impact on mutagenesis，Mutation Res，1998，400：135―142

第三節(jié) 重組(recombination) 重組的本質(zhì)是基因的重排或交換.即2個DNA分子間或一個DNA分子的不同部位間,通過斷裂和重接,交換DNA片段從而改變基因 的組合和序列.  一.同源重組(Homologous recombination) 指DNA同源序列間的重組,常發(fā)生于兩個較長的同源DNA片段或同源染色體之間。 可通過同源重組將外源基因定位整合到細(xì)胞基因組中.  二.轉(zhuǎn)座(transposition) 可移動的DNA元件(mobile DNA elements) -轉(zhuǎn)座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子內(nèi)或DNA分子間轉(zhuǎn)移的DNA片段. 轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)移過程-轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座的特點: 1.轉(zhuǎn)座后原來位置的轉(zhuǎn)座元件序列仍然保留,但同時又把新合成的DNA 復(fù)本插入到另外一個位點. 2.轉(zhuǎn)座過程需要轉(zhuǎn)座酶(transposase).它催化斷裂和重接兩步連續(xù)的 過程(需要M2+) 3.轉(zhuǎn)座元件插入位置的兩茶有3-12bp的正向重復(fù)序列(靶序列),它是由于轉(zhuǎn)座酶錯位切割DNA造成的.這種短正向重復(fù)序列 是存在轉(zhuǎn)座元件的特征. 轉(zhuǎn)座元件的分類 ①轉(zhuǎn)座子(transposon):通過DNA復(fù)制而轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座元件. ②逆轉(zhuǎn)座子(retroposon)或返座子,通過RNA階段實現(xiàn)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座元件 (DNA→ RNA→ DNA→ 插入新位點) 逆轉(zhuǎn)座子例:Alu.LINE1.逆假基因(retro-pseudogene) 轉(zhuǎn)座的遺傳效應(yīng)-導(dǎo)致基因重排、插入、缺失。