初級(jí)檢驗(yàn)技師考試輔導(dǎo):免疫印跡法

　　初級(jí)檢驗(yàn)技師考試輔導(dǎo):免疫印跡法

　　免疫印跡法(immunoblotting test，IBT)亦稱(chēng)酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(EITB)，因與Southern早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southern blot相類(lèi)似，亦被稱(chēng)為Western blot。免疫印跡法分三個(gè)階段進(jìn)行。第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽(yáng)泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓(100V)和大電流(1～2A)，通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍(lán)紫色)。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗(yàn)。抗原經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線(xiàn)條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。

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