2013年初級藥師輔導(dǎo)知識：蛋白質(zhì)純化及復(fù)性

　　重組蛋白在大腸桿菌(E. coli)高效表達時，往往以不溶的、無活性的蛋白聚集體，即包涵體(inclusion body)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。必須從細(xì)胞內(nèi)分離出包涵體，采用高濃度變性劑(如7.0mol/L鹽酸胍、8.0mol/L脲)溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復(fù)性，最后再用色譜法使目標(biāo)蛋白質(zhì)得到純化。其中包涵體蛋白的復(fù)性和純化是整個過程中的核心。

　　目前重組蛋白生產(chǎn)中普遍存在的問題是：

　　(1)工藝路線煩瑣，生產(chǎn)周期長。在傳統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)分離純化工藝中，大多采用經(jīng)典的軟凝膠分離介質(zhì)，由于這種介質(zhì)的顆粒較大，分離效率較差，因此常常需要采用多種不同模式的色譜操作聯(lián)用對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行純化，才能得到純度符合一定標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)蛋白質(zhì)。另外，這種色譜介質(zhì)的耐壓性很差，只能在流速較低的情況下進行操作，分離純化時間較長。分離純化步驟多和分離時間長使得蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率和活性回收率很低。而且在傳統(tǒng)的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)工藝中，蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化是生產(chǎn)過程中兩個獨立的單元操作，也在很大程度上制約著生產(chǎn)效率。

　　(2)生產(chǎn)成本高，設(shè)備投資大。由于復(fù)性和分離純化分別單獨進行，而且分離純化步驟多，每一步都需要有與之配套的設(shè)備，致使設(shè)備投資大，生產(chǎn)成本高。隨著生產(chǎn)規(guī)模的增加，這種弊端會愈來愈嚴(yán)重。

　　(3)復(fù)性效率低。傳統(tǒng)的復(fù)性方法稀釋法和透析法。稀釋復(fù)性法對樣品幾十倍，甚至上百倍的稀釋會使樣品的體積急劇增大，給后續(xù)的分離純化帶來很大的困難，而且復(fù)性過程中需要較大的復(fù)性容器。透析法耗時較長，而且要多次更換透析溶液。這兩種方法的共同缺點是蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中會發(fā)生聚集而產(chǎn)生大量沉淀，復(fù)性效率低，通常蛋白質(zhì)的活性回收率只有5~20%，而且復(fù)性后的蛋白質(zhì)溶液中含有大量的雜蛋白，需要進行進一步的分離純化。

　　1991年耿信篤教授首先將高效疏水相互作用色譜(HPHIC)用于變性蛋白的復(fù)性，很好的解決了上述問題，現(xiàn)已成功用于重組人干擾素-g(rhIFN-g)、重組人干擾素-a(rhIFN-a)、人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重組人胰島素原(proinsulin)、重組牛朊病毒(prion)等重組蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等標(biāo)準(zhǔn)模型蛋白的復(fù)性與同時純化中。目前，排阻色譜法、離子交換色譜法和親合色譜法也已用于蛋白質(zhì)的復(fù)性和同時純化中。與傳統(tǒng)的稀釋法及透析法比較，用色譜法進行蛋白復(fù)性的優(yōu)點是：

　?、僭诘鞍踪|(zhì)復(fù)性的同時可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離以達到純化的目的，使復(fù)性和純化同時進行;

　　②便于回收變性劑，以降低廢水處理成本。

　?、墼谶M樣后可很快除去變性劑;

　?、苡捎谏V固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附，可明顯地減少、甚至完全消除復(fù)性過程中蛋白質(zhì)聚集體和沉淀的產(chǎn)生，從而提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率;

　　簡言之，色譜法復(fù)性可以提高蛋白質(zhì)的活性和質(zhì)量回收率，將蛋白復(fù)性和純化集成在一步操作完成，縮短了操作步驟和生產(chǎn)時間，減少了設(shè)備投資，使生產(chǎn)成本大大降低，已經(jīng)引起了全世界范圍內(nèi)許多生化研究者和重組蛋白藥物生產(chǎn)廠家的關(guān)注。由于高效液相色譜(HPLC)分離效率高，往往在一步操作中便可得到純度符合要求的蛋白質(zhì)，而且分離速度快，在應(yīng)用方面具有更大的優(yōu)勢。

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