2013年初級藥師輔導知識：蛋白質純化及復性

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　　重組蛋白在大腸桿菌(E. coli)高效表達時，往往以不溶的、無活性的蛋白聚集體，即包涵體(inclusion body)的形式存在于細胞內。必須從細胞內分離出包涵體，采用高濃度變性劑(如7.0mol/L鹽酸胍、8.0mol/L脲)溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復性，最后再用色譜法使目標蛋白質得到純化。其中包涵體蛋白的復性和純化是整個過程中的核心。

　　目前重組蛋白生產中普遍存在的問題是：

　　(1)工藝路線煩瑣，生產周期長。在傳統(tǒng)的重組蛋白質分離純化工藝中，大多采用經典的軟凝膠分離介質，由于這種介質的顆粒較大，分離效率較差，因此常常需要采用多種不同模式的色譜操作聯(lián)用對目標蛋白質進行純化，才能得到純度符合一定標準的目標蛋白質。另外，這種色譜介質的耐壓性很差，只能在流速較低的情況下進行操作，分離純化時間較長。分離純化步驟多和分離時間長使得蛋白質的質量回收率和活性回收率很低。而且在傳統(tǒng)的重組蛋白質生產工藝中，蛋白質的復性和純化是生產過程中兩個獨立的單元操作，也在很大程度上制約著生產效率。

　　(2)生產成本高，設備投資大。由于復性和分離純化分別單獨進行，而且分離純化步驟多，每一步都需要有與之配套的設備，致使設備投資大，生產成本高。隨著生產規(guī)模的增加，這種弊端會愈來愈嚴重。

　　(3)復性效率低。傳統(tǒng)的復性方法稀釋法和透析法。稀釋復性法對樣品幾十倍，甚至上百倍的稀釋會使樣品的體積急劇增大，給后續(xù)的分離純化帶來很大的困難，而且復性過程中需要較大的復性容器。透析法耗時較長，而且要多次更換透析溶液。這兩種方法的共同缺點是蛋白質在復性過程中會發(fā)生聚集而產生大量沉淀，復性效率低，通常蛋白質的活性回收率只有5~20%，而且復性后的蛋白質溶液中含有大量的雜蛋白，需要進行進一步的分離純化。

　　1991年耿信篤教授首先將高效疏水相互作用色譜(HPHIC)用于變性蛋白的復性，很好的解決了上述問題，現(xiàn)已成功用于重組人干擾素-g(rhIFN-g)、重組人干擾素-a(rhIFN-a)、人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重組人胰島素原(proinsulin)、重組牛朊病毒(prion)等重組蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等標準模型蛋白的復性與同時純化中。目前，排阻色譜法、離子交換色譜法和親合色譜法也已用于蛋白質的復性和同時純化中。與傳統(tǒng)的稀釋法及透析法比較，用色譜法進行蛋白復性的優(yōu)點是：

　?、僭诘鞍踪|復性的同時可使目標蛋白質與雜蛋白分離以達到純化的目的，使復性和純化同時進行;

　　②便于回收變性劑，以降低廢水處理成本。

　　③在進樣后可很快除去變性劑;

　?、苡捎谏V固定相對變性蛋白質的吸附，可明顯地減少、甚至完全消除復性過程中蛋白質聚集體和沉淀的產生，從而提高蛋白質復性的質量和活性回收率;

　　簡言之，色譜法復性可以提高蛋白質的活性和質量回收率，將蛋白復性和純化集成在一步操作完成，縮短了操作步驟和生產時間，減少了設備投資，使生產成本大大降低，已經引起了全世界范圍內許多生化研究者和重組蛋白藥物生產廠家的關注。由于高效液相色譜(HPLC)分離效率高，往往在一步操作中便可得到純度符合要求的蛋白質，而且分離速度快，在應用方面具有更大的優(yōu)勢。

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