2012年初級(jí)藥士生物化學(xué)：DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能

　　(一)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

　　核酸是由很多單核苷酸聚合形成的多聚核苷酸(polynucleotide)，DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)即是指四種核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列順序，通過磷酸二酯鍵連接形成的多核苷酸，由于核苷酸之間的差異僅僅是堿基的不同，故又可稱為堿基順序。核苷酸之間的連接方式是：一個(gè)核苷酸的5′位磷酸與下一位核苷酸的3′-OH形成3′，5′磷酸二酯鍵，構(gòu)成不分支的線性大分子，其中磷酸基和戊糖基構(gòu)成DNA鏈的骨架，可變部分是堿基排列順序。核酸是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的5′位不再與其它核苷酸相連的5′末端，以及核苷酸的戊糖基3′位不再連有其它核苷酸的3′末端，兩個(gè)末端并不相同，生物學(xué)特性也有差異。

　　寡核苷酸(oligonucleotide)是指二至十個(gè)甚至更多個(gè)核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性多核苷酸片段。目前多由儀器自動(dòng)合成而用作DNA合成的引物(Primer)、基因探針(probe)等，在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中具有廣泛的用途。

　　表示一個(gè)核酸分子結(jié)構(gòu)的方法由繁至簡有許多種。由于核酸分子結(jié)構(gòu)除了兩端和堿基排列順序不同外，其它的均相同。因此，在核酸分子結(jié)構(gòu)的簡式表示方法中，僅須注明一個(gè)核酸分子的哪一端是5′末端，哪一端是3′末端，末端有無磷酸基，以及核酸分子中的堿基順序即可。如未特別注明5′和3′末端，一般約定，堿基序列的書寫是由左向右書寫，左側(cè)是5′末端，右側(cè)為3′末端。

　　(二)基因組DNA

　　自然界絕大多數(shù)生物體的遺傳信息貯存在DNA的核苷酸排列順序中。DNA是巨大的生物高分子，一般將細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者?染色體所包含的DNA總體稱為基因組(genome)。同一物種的基因組DNA含量總是恒定的，不同物種間基因組大小和復(fù)雜程度則差異極大，一般講，進(jìn)化程度越高的生物體其基因組構(gòu)成越大、越復(fù)雜，見(表15-2)。?

　　表15-2　某些有代表性的生物體內(nèi)DNA大小

　　DNA分子中不同排列順序的DNA區(qū)段構(gòu)成特定的功能單位，即基因(gene)?；虻墓δ苋Q于DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。一個(gè)DNA分子能攜帶多少基因呢?如果以1000～1500bp編碼一個(gè)基因計(jì)算，猿猴病毒SV40基因組DNA有5000堿基對(duì)(base pair，bp)，可編碼5種基因，人類基因組含3×109bp DNA，理論上可編碼200萬以上的基因，然而，由于哺乳動(dòng)物的基因含有內(nèi)含子(intorn)，因而每個(gè)基因可長達(dá)5000～8000bp，少數(shù)可達(dá)20，000bp.按這樣大小的基因進(jìn)行推算，人類基因組相當(dāng)于40～60萬個(gè)基因。這可能嗎?雖然現(xiàn)在還不知道確切數(shù)字，但利用核酸雜交已測(cè)得哺乳類細(xì)胞含50，000～100，000種mRNA，由此推論整個(gè)基因組所含基因不會(huì)超過10萬個(gè)，只占全部基因組的6%，另外5～10%為rRNA等重復(fù)基因，其余80～90%屬于非編碼區(qū)，沒有直接的遺傳學(xué)功能。DNA的復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這些非編碼區(qū)往往都是一些大量的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列或集中成簇，或分散在基因之間，可能在DNA復(fù)制、調(diào)控中具有重要意義，并與生物進(jìn)化、種族特異性有關(guān)?？梢娫思?xì)胞由于DNA分子較小，必須充分利用有限的核苷酸序列，這是真核基因組與原核基因組顯然不同之處。

　　真核基因組與原核基因組在結(jié)構(gòu)上還有很多不同的特點(diǎn)，歸納如下：

　　1.真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

　?、僬婧松锘蚪MDNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因組是雙份的(即雙倍體，diploid)，即有兩份同源的基因組。

　　②真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子(monocistron)，即一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成一個(gè)mRNA分子，一條多肽鏈。

　?、鄞嬖诖罅恐貜?fù)序列，即在整個(gè)DNA中有許多重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸順序，重復(fù)序列長度可長可短，短的僅含兩個(gè)核苷酸，長的多達(dá)數(shù)百、乃至上千。重復(fù)頻率也不盡相同;高度重復(fù)序列重復(fù)頻率可達(dá)106次，包括衛(wèi)星DNA、反向重復(fù)序列和較復(fù)雜的重復(fù)單位組成的重復(fù)序列;中度重復(fù)序列可達(dá)103～104次，如為數(shù)眾多的Alu家族序列，KpnI家族，Hinf家族序列，以及一些編碼區(qū)序列如rRNA基因、tRNA基因、組蛋白基因等;單拷貝或低度重復(fù)序列，指在整個(gè)基因組中只出現(xiàn)一次或很少幾次的核苷酸序列，主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，在人基因組中占約60～65%，因此所含信息量最大。

　?、芑蚪M中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。

　　⑤基因是不連續(xù)的，在真核生物結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部存在許多不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列(intervening sequences)，稱為內(nèi)含子(intron)，編碼區(qū)則稱為外顯子(exon)。內(nèi)含子與外顯子相間排列，轉(zhuǎn)錄時(shí)一起被轉(zhuǎn)錄下來，然后RNA中的內(nèi)含子被切掉，外顯子連接在一起成為成熟的mRNA，作為指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的模板。

　?、藁蚪M遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長度較小。

　　2.原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

　?、倩蚪M較小，沒有核膜包裹，且形式多樣，如病毒基因組可能是DNA，也可能是RNA，可能是單鏈的，也可能是雙鏈的，可能是閉環(huán)分子，也可能是線性分子;細(xì)菌染色體基因組則常為環(huán)狀雙鏈DNA分子，并與其中央的RNA和支架蛋白構(gòu)成一致密的區(qū)域，稱為類核(nucleoid)。

　?、诠δ芟嚓P(guān)的結(jié)構(gòu)基因常常串連在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA分子中，稱為多順反子mRNA(polycistronic mRNA)，然后再加工成各種蛋白質(zhì)的模板mRNA.

　?、跠NA分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，不編碼部分(又稱間隔區(qū))通常包含控制基因表達(dá)的順序。例如，噬菌體ψx 174中只有5%是非編碼區(qū)。

　?、芑蛑丿B是病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子。

　　⑤除真核細(xì)胞病毒外，基因是連續(xù)的，即不含內(nèi)含子序列。

　　(三)限制性片段長度多態(tài)性

　　隨著對(duì)基因認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在同種生物的不同個(gè)體之間，盡管其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能完全相同或僅存在著細(xì)微的差異，但在DNA水平卻存在著差異，尤其在不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域以及沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域表現(xiàn)更為突出。這種不影響生物體表型的DNA突變被稱為中性突變。

　　分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展已使得從DNA水平直接分析這類突變成為可能。

　　目前應(yīng)用較多且成熟的方法是限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)。即當(dāng)DNA序列中某一個(gè)堿基發(fā)生突變，使突變所在部位的DNA序列獲得或丟失某種限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn);或當(dāng)DNA分子內(nèi)部發(fā)生較大的順序突變?nèi)缛笔?、重?fù)、插入，或DNA高變區(qū)內(nèi)某串聯(lián)重復(fù)順序的拷貝數(shù)不同致使其兩側(cè)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)發(fā)生相對(duì)位移時(shí)，利用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化此DNA，便會(huì)產(chǎn)生與正常不同的限制性片段。這樣，在同種生物的不同個(gè)體中就會(huì)出現(xiàn)不同長度的限制性片段類型。

　　因?yàn)镈NA的中性突變常以孟德爾顯性遺傳方式遺傳給下一代，所以對(duì)這類突變檢測(cè)已廣泛用于遺傳病的診斷、產(chǎn)前診斷、親子鑒定以及法醫(yī)學(xué)上對(duì)罪犯的確認(rèn)等。

　　(四)DNA序列分析(DNa sequencing)

　　DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了基因的功能，欲想解釋基因的生物學(xué)含義，首先必須知道其DNA順序。因此DNA序列分析是分子遺傳學(xué)中一項(xiàng)既重要又基本的課題。

　　1986年由美國學(xué)者提出的，目前正在實(shí)施的人類基因組計(jì)劃(human genome project)，則是要通過對(duì)人類基因組3×109bp全序列的序列分析和人類基因的染色體圖譜制定達(dá)到了解其結(jié)構(gòu)，認(rèn)識(shí)其功能，即從分子遺傳學(xué)水平來認(rèn)識(shí)人類自身的結(jié)構(gòu)和功能特征的目的。

　　核酸的核苷酸序列測(cè)定方法已經(jīng)過近20年的發(fā)展，因而測(cè)序的具體方法五花八門、種類繁多。但是究其所依據(jù)的基本原理，不外乎Sanger的核酸鏈合成終止法及Maxam和Gilbert的化學(xué)降解法兩大類。雖然原理不同，但這兩種方法都同樣生成互相獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點(diǎn)，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或多種殘基上。由于DNA鏈上每一個(gè)堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會(huì)均等，因而上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸的混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅相差一個(gè)核苷酸的不同DNA分子的條件下，對(duì)各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測(cè)序凝膠中若干個(gè)相鄰的泳道之上，即可從凝膠的放射自顯影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。以下分別介紹。

　　1.Sanger雙脫氧鏈終止法

　　DNA的合成總是從5′端向3′端進(jìn)行的。DNA的合成需要模板以及相應(yīng)的引導(dǎo)核酸鏈。DNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3′末端，依據(jù)堿基配對(duì)的原則，通過生成新的3′，5′-磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的DNA鏈。具體測(cè)序工作中，平行進(jìn)行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸;并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測(cè)DNA的核苷酸序列。

　　2.Maxam?Gilbert DNA化學(xué)降解法

　　這一方法的基本步驟為(1)先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記(通常為放射性同位素32P;(2)在多組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾;(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈;(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開;(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列。

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